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乌司他丁通过SIRT1、PGC-1α调节氧化应激对失血性休克大鼠脑损伤的保护作用
添加时间: 2021/7/25 13:51:30 文章来源: 文章作者: 点击数:112

赵天补   田昌俊*

(苏州大学附属第二医院  急诊外科  215004  )

   

【摘要】目的:探讨乌司他丁失血性休克大鼠脑损伤的影响及其机制。方法:36只雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组和观察组,每组12只,对照组给与假手术,模型组造模后不予处理,观察组造模后予以乌司他丁静脉输注。记录造模时采血开始、采血结束、回输开始以及回输结束时的平均动脉压(MAP)、PH、碱剩余BE以及乳酸浓度La)。造模成功24h后检测海马组织线粒体超氧化物歧化酶( SOD) 活性以及丙二醛( MDA) 含量Western blot法测定海马组织中沉默信息调节因子(SIRT1)与过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1αPGC-1α两中蛋白的表达情况。结果:采血开始时和回输结束组大鼠MAP无统计学差异(P>0.05);模型组和观察组在采血结束回输开始MAP均低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。采血开始时三组大鼠PH值、BE值和La值无统计学差异(P>0.05);采血结束时、回输开始时模型组和观察组PH值降低、BE值降低、La值升高,差异具有统计学意义(P<0.05);回输结束时三组PH值无统计学差异(P>0.05),模型组和观察组BE值降低、La值升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。三组SOD活性由高到低分别为对照组、观察组和模型组,差异具有统计学意义(P<0.05)。三组MDA含量由高到低分别为模型组、观察组和对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示SIRT1PGC-1α蛋白表达水平由低到高均为对照组、模型组、观察组。结论:乌司他丁可通过促进SIRT1PGC-1α蛋白在海马组织中的表达,达到抗氧化应激的作用,发挥保护大鼠缺血-再灌注脑损伤的效果

【关键词】失血性休克;缺血再灌注损伤;乌司他丁;氧化应激反应;SIRT1PGC-1α

Ulinastatin regulates oxidative stress through SIRT1 and PGC-1 α to protect brain injury in rats with hemorrhagic shock

Zhao Tianbu   Tian Changjun*

(emergency surgery of the Second Affiliated Hospital of Suzhou University 215004)

[Abstract] Objective: To investigate the effect and mechanism of ulinastatin on brain injury in rats with hemorrhagic shock. Methods: 36 male SD rats were randomly divided into control group, model group and observation group, 12 rats in each group. The control group was given sham operation, the model group was not treated after modeling, and the observation group was given Ulinastatin intravenous infusion after modeling. The mean arterial pressure (map), pH, alkali surplus (be) and lactate concentration (LA) were recorded at the beginning, the end, the beginning and the end of the model. The activity of superoxide dismutase (SOD) and the content of malondialdehyde (MDA) in hippocampus were measured 24 hours after the establishment of the model. The expression of SIRT1 and PGC-1 α in hippocampus were measured by Western blot. Results: there was no significant difference in map between the model group and the observation group at the beginning of blood collection and at the end of reinfusion (P > 0.05). There was no statistical difference in pH, be and La between the three groups at the beginning of blood collection (P > 0.05); at the end of blood collection, at the beginning of reinfusion, the pH, be and La of the model group and the observation group decreased, and the difference was statistically significant (P < 0.05); at the end of reinfusion, there was no statistical difference in pH among the three groups (P > 0.05), the be and La of the model group and the observation group decreased, and the difference was statistically significant (P > 0.05). Significance (P < 0.05). The activity of SOD in the three groups from high to low were control group, observation group and model group, the difference was statistically significant (P < 0.05). The content of MDA in the three groups from high to low were model group, observation group and control group, the difference was statistically significant (P < 0.05). Western blot showed that SIRT1 and PGC-1 α protein expression levels were from low to high in the control group, model group and observation group. Conclusion: Ulinastatin can promote the expression of SIRT1 and PGC-1 α protein in hippocampus, achieve the effect of anti oxidative stress, and play the role of protecting the brain injury of ischemia-reperfusion rats.

[Key words] hemorrhagic shock; ischemia-reperfusion injury; Ulinastatin; oxidative stress response; SIRT1; PGC-1 α

失血性休克是临床常见的危急重症,主要是由于各种原因导致血容量短时间内急剧降低所导致。严重的失血性休克可引起机体众多器官组织的循环障碍、缺血缺氧,诱发多器官功能的障碍,脑组织是人体中枢器官,最不耐受缺血缺氧的环境,若不能及时补充血容量、恢复组织的供血供氧,容易导致病情进一步的恶化,进而死亡[1]。临床上目前首选的治疗方法是补液扩容,但液体复苏在短时间内补充大量血容量,容易导致脑组织的再灌注损伤,引发二次损害。目前已开展许多相关研究探寻治疗失血性休克再灌注脑损伤的有效方案,但由于各种原因,能应用于临床上的案例较少[2-4]。乌司他丁是一种蛋白酶抑制剂,具有多脏器保护作用,是常用的危急重症治疗药物。有研究显示,乌司他丁可改善缺血性损伤脑组织的能量代谢,减轻损伤程度,其机制可能与氧化应激相关[5]。沉默信息调节因子(SIRT1)与过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1αPGC-1α)是两种与氧化应激密切相关的因子,这两种因子的表达上调能够改善线粒体功能,减轻氧化应激反应。本研究拟从氧化应激入手探讨乌司他丁对失血性休克大鼠脑损伤的保护作用以及对SIRT1PGC-1α表达的影响,探讨乌司他丁保护脑损伤的机制,以期为临床治疗失血性休克脑缺血-再灌注损伤的治疗提供思路。

1 材料与方法

1.1 实验动物    SPF级健康成年雄性SD大鼠36只,体重300-350g,由浙江大学实验动物中心提供,自由进食饮水,饲养环境温度( 20-25) ℃,湿度50%-55% ,黑暗和光照各12h

1.2 试剂和仪器    乌司他丁针(国药准字H20040505,广东天普生化医药股份有限公司);线粒体提取试剂盒(美国 GENMED 公司);超氧化物歧化酶( SOD) 活性测定试剂盒丙二醛 ( MDA) 检测试剂盒、RIPA 裂解液 、BCA 蛋白浓度测定试剂盒均购自南京卡米洛生物工程有限公司β-actin单抗、PGC-1α单抗均购自 Proteintech公司;SIRT1单抗(美国 Cell SignalingTechnology 公司);ECL 显影液(南京知凡生物技术有限公司)。

1.3 实验方法

36只大鼠随机分为对照组、模型组和观察组,每组10只,适应性喂养7天后进行造模。造模前禁食8h,称重,腹腔注射3%戊巴比妥钠50mg/kg,仰卧固定在试验手术台,予以经口气管插管自由呼吸。头颈部使用碘伏消毒,颈正中逐层切开,分离出右侧颈总动脉和左颈静脉,插入PE-50管,管端连接三通,一口用于血液的采集,另一口用于检测平均动脉压(MAP) 。采集大鼠总血容量的40%制作失血性休克模型,1h后通过左侧颈静脉回输采集的全部血液,回输时间控制在30min内,建立再灌注损伤模型。对照组进行假手术,观察组在回输血液的同时混入10万单位/kg的乌司他丁。

1.4 观察指标

1.4.1 动态MAP监测    监测记录造模时采血开始、采血结束、回输开始以及回输结束时的MAP

1.4.2 动脉血气指标    在上述监测MAP4个时间点分别采集0.2ml动脉血进行血气分析,观察PH、碱剩余以及乳酸浓度等指标,同时回输时增加0.8ml生理盐水作为补充。

1.4.3 氧化应激标志物    造模完成24h,每组随机选取6只大鼠,3%戊巴比妥钠50mg/kg腹腔麻醉,断头取脑,分离出海马组织,称重,剪碎,加入线粒体裂解液,在4℃1500×g离心15min,取上层清液,10000×g离心15min后取沉淀物即为线粒体。BCA试剂盒测定线粒体蛋白浓度,按照SOD试剂盒说明书,测定线粒体样本SOD活性;其余每组6只大鼠断头取出海马组织同上,加入RIPA裂解液,充分研磨, 4 ℃13200/min下离心30 min,取上清,使用MDA试剂盒,按照说明书进行操作,比色法测定MDA含量。

1.4.4 SIRT1PGC-1α的表达    采用Western blot法,取上述各组剩余海马组织蛋白加入缓冲液100℃变性10min8% SDS-PAGE电泳分离,5%脱脂牛奶封闭1hTBST洗涤,加入β-actin单抗、SIRT1单抗以及PGC-1α单抗,4 ℃ 孵育过夜。暗室行ECL显影,SIRT1PGC-1α条带与β-actin条带进行比对,灰度值比值反映目的蛋白的表达水平

1.5 统计学方法    采用SPSS 22.0统计分析。计量资料以表示计数资料以[n (%)]表示,采用χ2检验。P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 动态MAP对比

如表1所示,采血开始时和回输结束组大鼠MAP无统计学差异(P>0.05);模型组和观察组在采血结束回输开始MAP均低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。

1 三组动态MAP对比kPa

分组

n

采血开始

采血结束

回输开始

回输结束

对照组

12

13.92±0.82

13.56±0.82

13.66±0.87

13.89±0.82

模型组

12

13.96±0.77

4.33±0.62*

7.16±0.63*

13.91±0.88

观察组

12

14.01±0.83

4.47±0.68*

7.22±0.41*

14.01±0.75

注:与对照组比较,*P<0.05

2.2 动态血气对比

如表2所示,采血开始时三组大鼠PH值、BE值和La值无统计学差异(P>0.05);采血结束时、回输开始时模型组和观察组PH值降低、BE值降低、La值升高,差异具有统计学意义(P<0.05);回输结束时三组PH值无统计学差异(P>0.05),模型组和观察组BE值降低、La值升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。

2 三组患者动态血气指标对比

项目

分组

n

采血开始

采血结束

回输开始

回输结束

PH

对照组

12

7.39±0.03

7.37±0.02

7.39±0.02

7.39±0.03

模型组

12

7.38±0.03

7.21±0.03*

7.28±0.02*

7.39±0.04

观察组

12

7.40±0.04

7.25±0.06*

7.30±0.01*

7.38±0.03

BEmmol/l

对照组

12

1.35±0.74

2.01±0.72

2.13±0.77

1.71±0.61

模型组

12

1.32±0.53

-9.85±1.03*

-5.91±0.93*

1.55±0.92*

观察组

12

1.39±0.85

-9.79±1.12*

-5.70±0.81*

1.06±0.66*

La

mmol/l

对照组

12

1.62±0.27

1.56±0.17

1.45±0.22

1.69±0.44

模型组

12

1.59±0.22

9.27±0.84*

5.57±0.72*

2.15±0.73*

观察组

12

1.69±0.34

9.66±1.13*

5.54±0.66*

2.39±0.83*

注:与对照组比较,*P<0.05

2.3 SOD活性检测

如图1所示,三组SOD活性由高到低分别为对照组、观察组和模型组,差异具有统计学意义(P<0.05)。

1 三组SOD活性比较

2.4 MDA含量比较

如图2所示,三组MDA含量由高到低分别为模型组、观察组和对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。

2 三组MDA含量比较

2.5 SIRT1PGC-1α蛋白表达情况

Western blot结果如图3所示,SIRT1PGC-1α蛋白表达水平由低到高均为对照组、模型组、观察组。

3  SIRT1PGC-1α蛋白表达情况比较

3 讨论

大脑是人体中枢,但最不耐缺氧环境,在失血性休克时容易出现损伤,休克后液体复苏时又容易出现再灌注损伤,因此在失血性休克时对脑组织的保护十分重要。在动物模型中已有多种脑损伤保护措施,但临床上尚无公认有效的治疗方法。乌司他丁是一种蛋白酶抑制剂,可通过抗炎、清除氧自由基来达到多脏器保护的功能,是一种强效的抗氧化剂,在临床危急重症患者中常用[6-8]本研究采用临床常用药物乌司他丁对失血性休克复苏的大鼠模型进行干预,观察其对脑损伤的影响,并探索其机制。

本研究采用失血性休克复苏的大鼠模型进行实验,通过动脉采血,静脉回输的方式进行造模,不仅能体现疾病本质,同时其可重复性好。结果显示,采血开始时和回输结束组大鼠MAP无统计学差异;模型组和观察组在采血结束回输开始MAP均低于对照组。此外,动态血气分析显示,采血开始时三组大鼠PH值、BE值和La值无统计学差异;采血结束时、回输开始时与对照组比较,模型组和观察组PH值降低、BE值降低、La值升高;回输结束时三组PH值无统计学差异,模型组和观察组较对照组BE值降低、La值升高。MAPPH值、BE值以及La值的动态变化符合失血性休克及复苏成功的表现,且各组大鼠均未出现死亡,说明此次造模成功,能够体现失血性休克复苏的主要病理特征。

脑组织的缺血-再灌注损伤是一个复杂的病理过程,包括炎性反应、氧化应激反应、代谢产物增加、组织毒性作用等等[9-11]MDASOD是重要的氧化应激标志物,MDA可反应氧化应激严重程度,而SOD是机体关键的抗氧化物质,能够反映机体抗氧化应激的能力[12]。本研究结果显示,三组SOD活性由高到低分别为对照组、观察组和模型组,三组MDA含量由高到低分别为模型组、观察组和对照组。究其原因,可能是大脑组织由于缺血缺氧导致活性氧蓄积、线粒体功能障碍、ATP生成减少,因而模型组MDA最高,而SOD水平最低,说明氧化应激反应较为严重,而观察组大鼠MDA较模型组低且SOD水平较模型组高,提示乌司他丁通过提高机体抗氧化应激反应的能力,减轻氧化应激,从而达到保护脑组织的作用。

为进一步探讨其机制,本研究分析了各组大鼠海马组织中SIRT1PGC-1α蛋白的表达情况。SIRT1是一种去乙酰化酶,可调控氧化应激、细胞凋亡以及神经元保护等过程,而PGC-1αSIRT1的底物之一,在维持线粒体功能方面具有重要作用[13][14]。有研究表明[15]SIRT1的表达增加可激活PGC-1α,从而调控线粒体功能,达到抗氧化、修复线粒体损伤的作用,进而提升机体或局部的抗氧化应激能力。本研究显示,SIRT1PGC-1α蛋白表达水平由低到高均为对照组、模型组、观察组。说明缺血再灌注导致了氧化应激反应增加,刺激了内源性的SIRT1PGC-1α蛋白表达上调,而使用乌司他丁可进一步提升SIRT1PGC-1α蛋白在海马组织中的表达水平,增强脑组织抵抗氧化应激损伤的能力。

综上所述,乌司他丁可通过促进SIRT1PGC-1α蛋白在海马组织中的表达,达到抗氧化应激的作用,发挥保护大鼠缺血-再灌注脑损伤的效果,值得进一步在临床试验中进一步探讨。

【参考文献】

[1] O Eroğlu, T Deniz, Ü Kisa, et al. Effect of hypothermia on apoptosis in traumatic brain injury and hemorrhagic shock model.[J]. Injury-international Journal of the Care of the Injured, 2017, 48(12):S0020138317306472.

[2] 黄丽  胡宪文  张慕春,. 线粒体通透性转换孔在七氟醚后处理减轻失血性休克复苏大鼠脑损伤中的作用[J]. 中华麻醉学杂志, 2018, 38(4):413-416.

[3] 张世洪, 叶凯丽. 缺血性脑损伤神经保护剂应用现状与研究进展[J]. 内科理论与实践, 2017(2):83-87.

[4] 李林  胡海姣  刁玉刚 ,. 损伤控制性复苏对低温失血性休克大鼠全脑缺血-再灌注损伤保护作用[J]. 创伤与急危重病医学, 2019(2):82-84.

[5] Sui B, Li Y, Ma L. Postconditioning improvement effects of ulinastatin on brain injury following cardiopulmonary resuscitation.[J]. Experimental & Therapeutic Medicine, 2014, 8(4):1301.

[6] Li X F, Zhang X J, Zhang C, et al. Ulinastatin protects brain against cerebral ischemia/reperfusion injury through inhibiting MMP-9 and alleviating loss of ZO-1 and occludin proteins in mice[J]. Experimental Neurology, 2018, 302:68-74.

[7] Feng C, Xuan S U, Zhou X, et al. Early peritoneal lavage with ulinastatin improves outcome and enhances multi-organ protection in a model of severe acute pancreatitis[J]. Experimental & Therapeutic Medicine, 2015, 9(4):1171-1177.

[8] Liu S, Xu J, Gao Y, et al. Multi-organ protection of ulinastatin in traumatic cardiac arrest model[J]. World Journal of Emergency Surgery, 2018, 13(1):51.

[9] Hosoo H, Marushima A, Nagasaki Y, et al. Neurovascular Unit Protection From Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury by Radical-Containing Nanoparticles in Mice.[J]. Stroke, 2017, 48(8):2238.

[10] Zou S, Zhang M, Feng L, et al. Protective effects of notoginsenoside R1 on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats:[J]. Experimental & Therapeutic Medicine, 2017, 14(6):6012-6016.

[11] Che N, Ma Y, Xin Y. Protective Role of Fucoidan in Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury through Inhibition of MAPK Signaling Pathway[J]. Biomolecules & Therapeutics, 2017, 25(3):272-278.

[12] 张巧莲, 李双英, 孙艳, . 氧化应激与缺血性脑卒中神经功能评分及神经功能恢复的相关性研究[J]. 现代医学, 2019, 47(03):49-53.

[13] Hong, YANG, Zheng-tao, et al. SIRT1 plays a neuroprotective role in traumatic brain injury in rats via inhibiting the p38 MAPK pathway[J]. Acta Pharmacologica Sinica, 2016, 38(2):168-181.

[14] Fu B, Zhang J, Zhang X, et al. Alpha-lipoic acid upregulates SIRT1-dependent PGC-1α expression and protects mouse brain against focal ischemia[J]. Neuroscience, 2014, 281:251-257.

[15] Dong W , Guo W , Wang F , et al. Electroacupuncture Upregulates SIRT1-Dependent PGC-1α Expression in SAMP8 Mice[J]. Medical Science Monitorinternational Medical Journal of Experimental\s&\sclinical Research, 2015, 21:3356-3362.

 
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