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促性腺激素-1b通过线粒体途径影响双氯甲醚诱发肺癌细胞凋亡和细胞周期停滞的机制研究
添加时间: 2021/7/25 13:48:21 文章来源: 文章作者: 点击数:110

 卓睿卿陈进华,刘江红

深圳市龙华区中心医院药学部 广东深圳 518110)

【摘要】目的:促性腺激素-1b通过线粒体途径影响双氯甲醚诱发肺癌细胞凋亡和细胞周期停滞的机制。方法:采用固相多肽合成促性腺激素-1b,并对其抗癌效果进行评价。结果:研究表明,促性腺激素-1b的抗癌活性不是通过细胞溶解得到的,最可能的原因是细胞凋亡。促性腺激素-1b在细胞G1期抑制癌细胞迁移、克隆形成和细胞阻滞。说明促性腺激素-1b具有多种肿瘤支持作用。进一步证实细胞凋亡的分子机制,采用FITC标记的促性腺激素-1b检测亚细胞定位,发现促性腺激素-1b与线粒体共定位,影响双氯甲醚,从而降低线粒体膜电位,增加了活性氧种类的水平和凋亡相关蛋白的表达(Bax/Bcl-2比值和激活caspase-3)。通过测定Bcl-2以及环孢素ACCCP治疗进一步阐明了促性腺激素-1b线粒体效应与细胞死亡的因果关系。结论:促性腺激素-1b可以进入细胞并与线粒体共定位,影响双氯甲醚。促性腺激素-1b处理后,NCI-H1299A549细胞线粒体膜电位下降,活性氧原种类增加,凋亡相关蛋白(Bax/Bcl-2比值和活化Caspase-3)表达增加,提示促性腺激素-1b通过线粒体通路诱导凋亡。

【关键词】促性腺激素-1b;线粒体;双氯甲醚;肺癌细胞

Effect of gonadotropin-1b on apoptosis and cell cycle arrest of lung cancer cells induced by dichloromethyl ether via mitochondrial pathway

ZHUO Ruiqing,CHEN Jinhua,LIU Jianghong

Department of Medicine,Shenzhen City Longhua  District central hospital Guangdong 518109China.

AbstractObjective: Gonadotropin-1b affects the mechanism of apoptosis and cell cycle arrest of lung cancer cells induced by dichloromethyl ether through mitochondrial pathway. Methods: Gonadotropin-1b was synthesized by solid-phase polypeptide and its anti-cancer effect was evaluated. Results: It was confirmed that the anticancer activity of gonadotropin-1b was not obtained by cell lysis. The most likely cause is apoptosis. Gonadotropin-1b inhibits the migration, cloning and cell arrest of cancer cells in G1 phase. It is suggested that gonadotropin-1b has multiple supporting effects on tumors. The molecular mechanism of apoptosis was further confirmed. FITC-labeled gonadotropin-1b was used to detect subcellular localization. For the first time, we found that co-localization of gonadotropin-1b with mitochondria affected dichloromethyl ether, thereby lowering mitochondrial membrane potential, increasing levels of reactive oxygen species and expression of apoptosis-related proteins (bax/bcl-2 ratio and activated caspase-3). We further elucidated the causal relationship between the mitochondrial effect of gonadotropin-1b and cell death by expressing Bcl-2 and cyclosporine A or CCCP. These data suggest that gonadotropin-1b influences dichloromethyl ether through mitochondrial-mediated pathway and induces apoptosis of cancer cells. Conclusion: Gonadotropin-1b can enter cells and co-localize with mitochondria, affecting dichloromethyl ether. After treatment with gonadotropin-1b, mitochondrial membrane potential of NCI-H1299 and A549 cells decreased, reactive oxygen species increased, and expression of apoptosis-related proteins (Bax/Bcl-2 ratio and activated Caspase-3) increased, suggesting that gonadotropin-1b induces apoptosis through mitochondrial pathway.

keywordsgonadotropin-1b; mitochondria; dichloromethyl ether; lung cancer cells

0 引言

肺癌是最常见的癌症之一,每年约有140万患者死于肺癌[1]。虽然在癌症的预防、诊断和治疗方面取得了很大的进展,但治愈率低于50%[2]。传统的肺癌治疗策略,包括手术、化疗和放疗,并不能保证肺癌患者预后良好,最近的报道显示,肺癌的5年生存率只有16%[3]。因此,开发超越传统治疗方法的新药正成为迫切需要。双氯甲醚对人肺癌A549细胞生长的抑制作用明显,且随浓度及时间的增加抑制作用增强。促性腺激素-1b免疫反应活性在非小细胞肺癌细胞系中表达较多,在小细胞癌中表达较少[4-5]。尽管有证据表明,促性腺激素-1b对多种人类癌细胞具有广泛的抗肿瘤活性[6-7],但其机制在很大程度上仍不为人知。线粒体功能障碍对癌症治疗至关重要。促性腺激素-1b具有较弱的溶血活性,促性腺激素-1b可以使线粒体膜电位去极化影响双氯甲醚,并通过线粒体途径诱导癌细胞凋亡。

1 资料与方法

1.1 试剂和抗体

细胞培养试剂(RPMI 1640DMEM)购自Cibco,胎牛血清(FBS)购自PAN生技公司: 3-(4.5-二甲基-2-噻唑啉)-2,5-二苯基-2-h-四氮唑溴化锂(MTT)购自Sangon生技公司,NMPDMFDCM、二甲基亚砜等常用试剂均购自国药控股化学试剂有限公司。RINK酰胺MBHA树脂购于天津南开和诚科技有限公司。n-乙酰-l-半胱氨酸(NAC)、环孢素A和羰基氰化物间氯苯肼(CCCP)均来自MCE。细胞周期和凋亡分析试剂盒来自Yeasen。活性氧种类测定试剂盒、Mito-Tracker Red CMXRosJc -1线粒体膜电位测定试剂盒、Hoechst 33258、乳酸脱氢酶(LDH)释放测定试剂盒、DAPI分别来自Beyotimefmoc保护氨基酸来自上海GL生化L td,裂解抗体-和总Caspase-3来自细胞信号技术,BaxBcl-2抗体均来自proteinintech

1.2 合成促性腺激素-1b

促性腺激素-1b的合成采用了固相多肽合成(SPPS),包括链长、肽段从树脂中裂解和分离。采用反相制备高效液相色谱(SHL MADZU (LC-6A) RP-HPLC)纯化肽段。采用C18柱,流速为10ml/min。肽段经75%缓冲液A (0.1% TFA的乙腈)线性梯度洗脱50min纯化,缓冲液A10%。肽段采用Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000中的分析柱进行分析。高分辨质谱(HR-O-TOF-MS)在安捷伦6530精密质谱Q-TOF LC/MS质谱仪上测定。

1.3 肽的FITC标记

肽的FITC标记在拉长后,进行复分解反应4 h。去除Fmoc组后,用Fmoc-Bala2当量)、HCTU2当量)和Diea4当量)处理树脂1 h。在室温下去除Fmoc组过夜后添加荧光素异硫氰酸盐(FITC2当量)和dipea3当量),按照一般方案分离和纯化肽。

1.4 细胞培养

NCI-H1299A549H460He pG2PLC均来自于美国类型培养(ATCC)。细胞在RPMI 1640培养基或添加10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。细胞在37培养,其中5% CO295%空气。

1.5 细胞生存能力

细胞在96孔板中培养。经不同处理后,将MTT溶液以1 mg/ml的最终浓度添加到每个孔中,并在37下将细胞培养4小时。丢弃培养基并添加DMSO溶解。在490nm处测量吸光度。

1.6 溶血性活动

将红细胞离心,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次。细胞用PBS稀释成4%v/v),然后用200ml注入96个孔板,每孔加入不同浓度的脂蛋白-1b。将培养皿在37培养1 h,然后以1000 rpm离心10 min。将上清液(100 ml)转移到96孔培养皿中,在540 nm处测量吸光度。PBS检测阴性对照,Triton X-100检测阳性对照。

溶血率=(样品-阴性对照)/(阳性对照-阴性对照)×100%

1.7 LDH释放

根据说明书,使用LDH细胞毒性试验试剂盒测定LDH的释放。根据细胞的大小,将适量的细胞接种到96孔板中。吸取培养基,PBS冲洗一次。更换新的培养基(1%血清的低血清培养基或适当的无血清培养基),并加入适当浓度的肽,继续正常培养。在预定检测时间前1h,将细胞培养皿取出培养箱,将试剂盒提供的LDH释放试剂加入样品最大酶活性控制孔。加入量为原培养液体积的10%。加入LDH释放试剂后,反复混匀几次,在细胞培养池中进一步培养。细胞培养板达到预定时间后,400 g离心5 min,上清(100 uL)转移到96孔板上,490 nm处测吸光度。

1.8 伤口愈合实验

6孔板的背面画一些平行线。将适量的细胞接种到6孔板中,当细胞充满时,用垂直于平行线的200毫升移液管尖端划两道划痕。吸取培养基,用PBS洗涤一次,去除被刮去的漂浮细胞。添加2毫升新鲜介质,并在不同时间拍摄划痕照片。

1.9 单独分析

将细胞接种到6孔板(每孔400个细胞)中,生长10-14天。用多聚甲醛(4.0% v/v)固定菌落,用结晶紫(0.5% w/v)染色并拍照。

1.10 细胞周期分析

采用细胞周期和凋亡分析试剂盒,按照说明书进行测定,制备单细胞悬浮液。取细胞1000g离心5min,弃上清液,用1mL预冷PBS冲洗细胞1次,离心收集细胞。细胞沉淀1ml预冷70%乙醇,轻轻混合,固定在2hat-20C以上。细胞用预冷PBS洗涤三次。在0.5毫升染色缓冲液中加入10毫升碘化丙定(PI)储存液和10毫升核糖核酸酶A溶液。37避光培养30分钟,流式细胞仪检测。

1.11 细胞凋亡检测

细胞凋亡分析按照说明书进行测量。总之,吸取细胞培养液,用胰蛋白酶(不含EDTA)消化细胞,制备单细胞悬浮液。用4c预冷PBS洗涤池2次,每次需要300g4c离心5分钟,用250ml结合缓冲液重新悬浮细胞,加入5ml膜联蛋白V-Alexa Fluor 48810mlpito 100ml细胞悬液,在室温下黑暗处反应15分钟,加入400ml PBS,混匀,1h内用流式细胞仪检测样品。

1.12 细胞结合和摄取

取适量细胞接种于12孔板中,用FITC标记促性腺激素-1b培养,PBS洗涤2次。用胰蛋白酶消化细胞,制备单细胞悬液。细胞在PBS中复苏,然后用血流容积法测定FITC。采用NovoExpress软件对每个样本共20000个细胞进行分析,平均荧光强度进行分析。

1.13 亚细胞定位

将适量细胞接种于激光共聚焦培养皿中,以特定浓度和时间用FITC-标记促性腺激素-1b培养。然后根据说明书,用Mito跟踪器标记线粒体红色CMXRosPBS3次,100 ng/mL DAPI37培养5 minPBS3次,激光扫描共聚焦显微镜拍照。

1.14 线粒体膜电位测定(C-1)

细胞接种于24孔板中,用促性腺激素-1b处理。吸取细胞培养液,用PBS冲洗,加入JC-1染色工质1ml,拌匀。细胞37培养20 min,培养后弃上清液,用JC-1染色缓冲液洗涤2次。加入2mL细胞培养液,荧光显微镜下观察。用Image J软件分析平均荧光强度。

1.15 活性氧种类测定

用无血清培养基1:1000稀释DCFH-DA,最终浓度为10 mmol/L。取细胞培养液,用适量的DCFH-DA稀释。细胞37培养20 min,用无血清细胞培养液冲洗3次。经促性腺激素-1bNAC处理后,用微平板阅读器检测荧光强度。

1.16 免疫印迹分析

细胞裂解后用BCA法测定蛋白浓度。蛋白经SDS-PAGE处理,转移至PVDF膜上,于4检测指定的一抗(BaxBcl-2Cleaved-total-Caspase-3)。涤去除未结合的一抗后,在室温下加入二抗1 h, ECL观察蛋白,Image J软件量化蛋白量。

1.17 统计分析

本研究中数据全部采用GraphPad Prism 5.0统计分析软件进行处理。采用方差分析计量数据,数据结果采用均数±标准差表示,采用的统计学方法包括t检验、双因素方差分析,再进行Bonferroni多重比较检验,P<0.05代表差异存在统计学意义。

2. 结果

2.1 促性腺激素-1b诱导肺癌细胞凋亡

采用人肝癌细胞(HepG2PLC)和人肺癌细胞(NCIH1299A549H460) MTT法测定了促性腺激素-1b的体外抗肿瘤活性,结果表明NCL-H1299A549细胞对促性腺激素-1b更敏感(1)

1 促性腺激素-1b的体外抗肿瘤活性

细胞生存能力(%

促性腺激素-1b(μm)

F

P

0

1

2.5

5

10

H460

102.67

96.79

90.96

75.89

63.78

12.345

0.011

H1299

102.67

80.65

78.86

57.09

39.08

8.344

0.014

A549

102.67

79.90

69.07

40.12

36.87

9.456

0.012

PLC

102.67

86.39

74.58

46.59

37.04

9.457

0.013

F

11.456

9.546

10.768

9.654

8.456

-

-

P

0.014

0.016

0.011

0.013

0.016

-

-

为了确定促性腺激素-1b是否损伤细胞膜,通过检测红细胞溶血和LDH释放,得知,促性腺激素-1b在高浓度的NCI H1299细胞中溶血活性较低(2)

2 促性腺激素-1b对红细胞的溶血活性

促性腺激素-1b(μm)

0

0.1

0.5

2

10

20

溶血率(%

0

1

1.8

1.6

1.7

2.1

F

8.616

9.484

11.345

5.667

6.746

8.375

P

0.004

0.008

0.013

0.014

0.003

0.005

当不同浓度的促性腺激素-1b培养NCL-H1299细胞24h时,培养基中未检测到LDH(3)

3 促性腺激素-1b LDH的释放情况

促性腺激素-1b(μm)

0

0.2

0.7

2.2

8

16

LDH释放率(%

0

2.34

1.86

3.36

3.25

3.98

F

10.345

8.544

10.365

8.553

7.875

10.466

P

0.014

0.015

0.009

0.0112

0.011

0.008

2.2 促性腺激素-1b在细胞周期G1期抑制癌细胞迁移、克隆形成和抑制细胞生长

迁移实验表明促性腺激素-1b抑制了NCI H1299细胞的迁移。为了检测细胞周期进展的分布情况,采用流式细胞术进行基于DNA的细胞周期分析。与对照组相比,促性腺激素-1bNCL-H1299细胞上的培养增加了G1期细胞的比例。(图1

1 促性腺激素-1b抑制肺癌细胞的迁移,并介导细胞周期阻滞  促性腺激素-1b抑制NCIH1299细胞迁移细胞

2.3 促性腺激素-1bNCI-H1299A549细胞中的定位

MTT实验表明,促性腺激素-1b具有明显的抗增殖活性,因此,检测促性腺激素-1b的吸收曲线,揭示其抗增殖活性与吸收曲线之间的关系。FITC标记的促性腺激素-1b与单独的促性腺激素-1b具有相同的细胞毒性作用。并进一步通过流式细胞术检测细胞吸收。与单独的促性腺激素-1b处理的细胞相比,FTTC标记的促性腺激素-1b细胞荧光增强,表明在NCI-H1299A549细胞中,促性腺激素-1b浓度越高,细胞结合越强。促性腺激素-1b与线粒体特异性染料MitoTrackerNCI-H1299A549细胞中共定位表明促性腺激素-1b诱导的肺癌细胞凋亡可能与线粒体有关。(图2

NCI-H1299

A549

2 NCI-H1299A549细胞中,促性腺激素-1bFITC标记促性腺激素-1b,绿色)与线粒体(有丝分裂钳,红色)的共定位

2.4 促性腺激素-1b通过线粒体依赖途径诱导肺癌细胞凋亡

通过荧光探针JC-1测量线粒体膜电位(MMP)。与对照组相比,促性腺激素-1b处理NCI-H1299细胞后的MMP呈剂量依赖性,可见荧光强度由红变灰的比值降低,说明促性腺激素-1b破坏了线粒体。流式细胞仪分析双氯甲醚对A549NCI-H1299细胞周期及其凋亡的影响(表4)。

4 流式细胞仪分析双氯甲醚对A549 NCI-H1299细胞周期及其凋亡的影响

组别

n

细胞周期

G1%

S%

G2%

对照组

3

53.2±0.2

41.2±0.3

7.9±0.2

双氯甲醚处理组

5mg/L

3

54.7±0.3

37.4±0.1

5.6±0.1

10mg/L

3

60.9±0.3

33.7±0.4

3.3±0.4

促性腺激素-1b显著增加了NCI-H1299A549细胞中ROS清除剂N-acetly半胱氨酸(NAC)可有效清除细胞内ROS(表5)。Bd-2过表达可以挽救促性腺激素-1b诱导的细胞死亡(6)

5促性腺激素-1bNCI-H1299细胞中ROS生成的影响

活跃的氧含量

+

-

+

NAC

0.36 ±0.03

0.97± 0.02

0.34 ±0.04

F

11.584

8.595

7.889

P

0.004

0.006

0.003

6 Bcl-2过表达对促性腺激素-1b处理NCI-H1299细胞活力的影响

Bcl-2

CCCP

促性腺激素-1b

35.28±4.37

26.45±2.91

F

12.894

11.775

P

0.003

0.006

3. 讨论

促性腺激素-1b诱导细胞死亡的机制多种多样,如破坏靶细胞的细胞膜,或引起靶细胞的渗透和肿胀[8]。线粒体是一种具有生物能量、生物合成和信号传递功能的细胞器,对于癌细胞适应环境非常重要[9]尽管近几十年来,我们在癌症和其他根治性疾病方面取得了很大的进展,但由于不良的副作用,尤其是在化疗方面,问题仍然不断出现[10-11]促性腺激素-1b为开发替代抗癌药物提供了一种新的策略。然而,其抗癌活性的分子机制尚不清楚[12-13]。有两种常见的机制:1)通过破坏胶束化或孔形成的细胞膜,2)通过破坏线粒体膜诱导细胞凋亡[14-15]促性腺激素-1b对耐药细菌具有较强的广谱活性。然而,其抗癌活性的机制仍不为人知。

通过MTT法测定了促性腺激素-1b的体外抗肿瘤活性,促性腺激素-1b治疗显著增加了NCL H1299A549细胞的凋亡细胞数量,得知促性腺激素-1b诱导肺癌细胞凋亡,但对细胞膜无损伤。迁移实验表明促性腺激素-1b在细胞周期G1期抑制癌细胞迁移、克隆形成和抑制细胞生长。FITC标记的促性腺激素-1b与单独的促性腺激素-1b相比,FTTC标记的促性腺激素-1b细胞荧光增强,表明在NCI-H1299A549细胞中,促性腺激素-1b浓度越高,细胞结合越强。Annexin V流式细胞仪和Pl染色显示,促性腺激素-1b治疗显著增加了NCL H1299A549细胞的凋亡细胞数量。线粒体功能障碍对凋亡通路至关重要,线粒体通透性过渡孔的开放导致跨膜电位的去极化。荧光探针JC-1用来测量说明促性腺激素-1b破坏了线粒体。促性腺激素-1b与线粒体共定位,降低了线粒体膜电位,增加了活性氧种类的水平和凋亡相关蛋白的表达。为了建立MMP与促性腺激素-1b诱导细胞死亡之间的关系,我们对NCI-H1299A549细胞进行了渗透过渡抑制剂环孢素A的预处理,环孢素A能有效预排促性腺激素-1b诱导的细胞死亡。解偶联剂CCCP用于线粒体的化学去极化,抑制促性腺激素-1b的线粒体聚集。在NCI-H1299细胞中,CCCP预处理可以显著防止细胞死亡。通过测定Bcl-2以及环孢素ACCCP治疗进一步阐明了促性腺激素-1b线粒体效应与细胞死亡的因果关系

促性腺激素-1b的抗肿瘤分子机制有助于为具有广谱抗癌活性。然而,促性腺激素-1b蛋白水解稳定性是临床应用的主要障碍[16]。虽然在一定程度上能够提高促性腺激素-1b的抗肿瘤活性和蛋白水解稳定性[17-19],但要临床应用,促性腺激素-1b需要具有高特异性的抗肿瘤活性和良好的血清稳定性[20]

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