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通过反应机制研究合成α, α-二烷基- α-氨基酸的生物催化方法
添加时间: 2010-5-19 22:47:38 文章来源: 文章作者: 点击数:1971
 
α, α-二烷基- α-氨基酸在作为药物构成,酶抑制剂,生理活性多肽的修饰等方面具有重要作用,这些化合物不能从自然界获得,合成也是一个巨大的挑战,包括一些步骤,并且很难控制反应的立体选择性。
酶催化用于醛和氨基酸之间的aldol反应提供了合成β-羟基-α-氨基酸的立体选择路径。醛缩酶应用于aldol反应对于受体醛而言是适合的,但对于供体化合物却是很严格的。到现在为止,只有甘氨酸可以作为供体,其他氨基酸的使用可能会增加β-羟基-α, α-二烷基- α-氨基酸的可能产物范围。近来,通过使用丙氨酸消旋酶催化苯甲醛与D-丙氨酸反应以地产率(12%)合成了α-甲基-3-硝基-β-吲哚。α-甲基丝氨酸羟甲基转化在E. coli中被过于提出用于甲醛和D-丙氨酸以64%的产率转化成甲基-L-丝氨酸,L-2-氨基丁酸转换成α-乙基-L-丝氨酸(55%产率)。没有更多的例子被给出。
近来,我们小组通过使用丝氨酸醛缩酶对对映β-羟基-α-氨基酸的生物催化研究已经获得了进展。在蛋白质催化不对称合成α, α-二烷基- α-氨基酸的一个研究中,我们发现了两个天然的丝氨酸缩醛酶,用于催化外消旋α-甲基苏氨酸(1)裂解成乙醛和D-丙氨酸:L-allo-丝氨酸缩醛酶来自Aeromonas jandaei (L-TA),   D-丝氨酸缩醛酶来自Pseudomonas sp. (d-TA; Scheme 1).
这个反应具有很好的对映立体选择性:只有L-1被L-TA立体选择性地分裂,只有D异构体被D-TA接受(详见SI),由于aldol反应的不可逆性,α-甲基苏氨酸通过L-TA或D-TA催化乙醛与过量丙氨酸(作为供体)的aldol加成反应被合成。
为了获得更多有关两种酶作为供体-受体特性的信息,以及找到其他的β-羟基-α, α-二烷基-α-氨基酸的合成方法,我们选择了一个反应机制研究。在丝氨酸缩醛酶中,磷酸吡哆醛(PLP)被连接在活性中心内的懒氨酸残基中。在供体氨基酸进入活性中心后,它被连接在PHP上,通过质子提取,最大吸收波长在498nm的醌式结构形成(scheme 2).除了甘氨酸以外,只有D-丙氨酸和D-丝氨酸(不是各自的L对映异构体)能够和前面指出的D-TA与L-TA形成络合物,相应的光谱也发生改变(Figure 1)D-半胱氨酸在498 nm显示一个很弱的吸收峰,由于PLP与半胱氨酸连接形成了噻唑烷,在330nm处还有一个附加的最大吸收峰。
 
 
为了发现潜在的供体,我们以一系列的醛作为受体,以D-丙氨酸,D-丝氨酸,或D-半胱氨酸作为供体(scheme 3;Table1)一系列的L-和D-烷基丝氨酸衍生物被成功的合成,在α-碳原子具有很好的对映特异性,(大于99%的产率,table 1)L-TA受体的特异性与先前报导的以甘氨酸作为供体的反应相似。最好的底物是带有吸电子基团的芳香醛,这些吸电子基团能够增加受体的亲电活性。例如,3-硝基苯甲醛能够以60%的产率有效地转化成L-3,而未被取代的L-2却以35%的低产率获得(table 1,entries 2 and 3)在L-TA催化反应中,非对映异构体的热力学混合物(产率低于40%)经常形成。这个能够通过平衡不利位置来解释,这种情况能够迅速到达,另外,与D-TA衍生物的反应中平衡状态后达到。
 
结果,非对映异构体比例增加(高于95%),在动力学控制下获得中等的产率。D-TA 显示,受体羰基化合物具有很宽的弹性,其中脂肪醛是最好的底物,光学活性的纯长链D-6作为球壳菌素和抗生素E和F的一种可能前体,以84%的产率获得,超过33%的非对映异构体。与D-丝氨酸和D-半胱氨酸的反应经常获得一个更低产率,与α-甲基类似物的反应相比(Table 1, entries 7–12 and 19–24)。
我们的结果证明了,以苏氨酸缩醛酶催化不对称aldol反应合成取代苏氨酸衍生物的例子。而且,我们的发现提供了通过使用L-TA或D-TA获得对映体的可能方法。
使用天然的酶催化反应,选择性往往很差,这可以通过酶工程解决,例如,通过合理的蛋白质设计以及直接的演变来提高生物催化效率。另外一个有前途的取舍可能是β-羟基-α,α-二烷基-α-氨基酸的烃基化去除羟基以此获得光学活性的纯L-或D-α,α-二烷基-α-氨基酸。
最后,在缩醛酶试验中为了找到供体特异性的一个可能解释,我们设计了来自A. jandaei公司基于从海栖热袍菌提取的L-TA的已知晶体结构的同系列模型反应。苯基丝氨酸缩醛酶来自恶臭假单胞菌。这两种酶都不能接受供体除甘氨酸以外,然而,它们的结构与来自A. jandaei公司的L-TA相比,在底物结合部位内,并没有明显的不同,这就可以解释我们研究的L-TA的特异性,似乎供体特异性是多种络合物相互作用的结果。
来自A. jandaei公司的L-TA对于供体的D异构体的严格特异性能通过模仿丙氨酸对映体同系物的活性部位(Figure 2)。氨基酸与PLP辅助因子结合形成希夫碱,在这个结构中Ca_H键必须与PLP环平面相垂直以更好地裂开。在这种情况下,D-丙氨酸的α质子(与甘氨酸中的Pro-2s质子相对应)最有可能从水分子获得,这些水分子被带有负电荷的PLP磷酸盐活化了,辅助因子反面的组氨酸85以及组氨酸128对立于辅助因子正面的懒氨酸,懒氨酸199.底物醛从同样的一侧进入了活性中心,在这一侧,C-C键形成维持着α-C原子的构型,组氨酸85和可能的组氨酸128可能是位于L产物的CΒ位的羟基的进一步质子化的候补。另外,当L-丙氨酸与PLP结合,Cα的脱质子化必然发生在PLP的反面。然而,在可以作为催化部位的这个区域没有发现残基,因此,只有供体的D异构体能脱质子与辅酶形成醌式络合物。提出的机理的更多细节在支持信息中给出。
目前,D-苏氨酸缩醛酶的晶体结构还未获得,但是它与细菌性的丙氨酸消旋酶的相似性基于氨基酸系列被假定,相似于来自嗜热脂肪芽胞杆菌的丙氨酸消旋酶,D-TA的催化机理可能包括两个催化部位,位于PLP的反面,因此,α质子可以从位于PLP环一面的部位的D-丙氨酸获得,但是底物的结合和β-羟基的质子化可能发生在产生D-构型产物的另一面,第二个部位必定远离Cα以防止丙氨酸的外消旋化。
总之,我们首次发现了能够接受其他供体,而不仅仅是甘氨酸的天然的苏氨酸缩醛酶,例如,丙氨酸,苏氨酸,半胱氨酸。作为供体由L-TA和D-TA证明的D-氨基酸的严格特异性提供了关于活性中心底物位置的机理差异的另一种见解。我们的发现增加了缩醛酶的底物范围并为极有用的对映纯L-或D-α-烷基丝氨酸衍生物的独特而又简单的生物催化合成开创了新的方法。而且,这些酶的高对映纯选择性能用于化学产生的β-羟基α-季氨基酸dl-syn或dl-anti混合物从而获得纯的非对映异构体,这些用于提高反应方案的对映立体选择性和最优化的苏氨酸缩醛酶遗传工程将是进一步提高生物催化转化结果的可选择办法。
 
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